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qPCR實驗中經常忽略的實驗細節(jié)？你有被cue了嗎？（qpcr實驗步驟詳細）

圖片來源：網絡

在實時熒光定量PCR ( qPCR )實驗中，每一個細節(jié)都可能影響結果的準確性和可靠性。然而，在忙碌的實驗過程中，我們往往會忽略一些看似微不足道但至關重要的步驟。今天，就讓我們一起回顧那些常被cue到但又常被忽略的實驗細節(jié)吧！

RNA提取與質量檢測

(1) RNA完整性:?提取后的RNA首先要檢測其完整性。瓊脂糖凝膠電泳是常用方法，觀察28S、18S及5S RNA條帶是否清晰，28S條帶強度是否約為18S的兩倍。有興趣的朋友可以瀏覽《不跑電泳就談RNA質量好壞的，都是耍流氓！》。另外，使用Agilent BioAnalyzer檢測RIN值，雖成本高但更準確。

(2) RNA產量:?使用Nanodrop等儀器準確評估RNA產量，確保后續(xù)實驗順利進行，小編在這篇文章( 《實驗技能 | 第二期：常見核酸（RNA）提取和純化的方法》 )中系統(tǒng)的介紹了RNA提取過程。

去除基因組DNA污染

DNase處理: RNA中的基因組DNA污染可能導致PCR假陽性。使用DNase處理RNA是簡單有效的方法，確保逆轉錄前RNA的純凈。

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圖片來源：GenStar官網

逆轉錄引物的選擇

引物類型:?根據實驗需求選擇合適的逆轉錄引物，如oligo dT、隨機引物或基因特異性引物。混合使用oligo dT和隨機引物可提高逆轉錄效率。

qPCR反應體系配制

(1) 避免污染:?使用新的、無污染的槍頭和離心管，避免交叉污染。

(2) 試劑保存:?含有SYBR Green等熒光染料的試劑應避光保存，防止熒光淬滅。另外，不同的qPCR儀器匹配不同的qPCR試劑，例如ABI 7500需要含Low ROX染料的qPCR試劑， ABI 7000需要含High ROX染料。詳細可瀏覽這篇文章《一文讀懂常規(guī)PCR？多重PCR？多重qPCR？“全家桶”大合集來襲（技術支持必備）》。

(3) 引物濃度: 優(yōu)化引物濃度，通常在0.1-0.4μM之間，起始推薦使用0.3μM/each。

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圖片來源：GenStar官網

反應條件優(yōu)化

(1) 退火溫度:?根據引物Tm值優(yōu)化退火溫度，確保特異性擴增。

(2) Mg2?濃度: Mg2?濃度影響DNA聚合酶活性，需根據具體實驗調整。現(xiàn)在商品化SYBR qPCR mix中的 Mg2?濃度都是調整好的，除非有特殊需求才需要根據具體實驗調整Mg2?濃度。

實驗設置與數據分析

(1) 設置陰性對照: 以PCR水替代模板設置陰性對照，排除模板污染造成的假陽性。另外，可以通過這篇文章了解一些qPCR實驗的名詞解釋《 qPCR實驗中的陽性對照，陰性對照，目標樣本，NTC和NRT的概念》。

(2) 閾值設置: 合理設置熒光閾值，確保Ct值準確反映起始模板數量。

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(3) 標準曲線: 繪制標準曲線，確保擴增效率在90-110%之間，相關系數R2大于0.98。

避免非特異性擴增

(1) 引物設計:?引物設計應避免互補序列，3’端避免連續(xù)三個以上的G或C?？梢酝ㄟ^這篇文章了解引物設計《干貨 | NCBI/Oligo 7/primer 5 三種方法進行PCR引物設計教程》。

(2) 優(yōu)化PCR程序:?若熔解曲線出現(xiàn)雜峰，考慮將兩步法更換為三步法或重新設計引物。

儀器校準與維護

(1) 定期校準:?定期校準qPCR儀器，確保數據準確可靠。

(2) 移液器精度: 使用高精度移液器，減少加樣誤差。如何校準移液器的精度可以瀏覽這篇文章《手把手教你，移液器校準》。

在qPCR實驗中，每一個細節(jié)都至關重要。希望今天的分享能讓大家更加重視這些常被忽略的實驗細節(jié)，從而獲得更加準確、可靠的實驗結果。你，被cue到了嗎？趕緊行動起來，優(yōu)化你的qPCR實驗吧！

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